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经典收藏:牛ELISA试剂盒实验的六大阶段

提供者:上海劲马实验设备有限公司 发布时间:2017/10/18 阅读次数:126次 进入该公司展台

    上海劲马公司是中国优秀的领先ELISA试剂盒研发、代理商之一,同时为广大实验室提供更好的熟悉和掌握ELISA技术,上海劲马专门分析整理出了牛ELISA试剂盒实验的六大阶段,供各位老师和同学观摩!

● 第1阶段:捕获抗体包板;
   1.将捕获抗体稍作离心,使抗体集中于管底;
   2.用无菌水将捕获抗体重悬至说明书上要求的浓度,静置10分钟以使抗体完全溶解;
   3.重悬的抗体以最高速度离心3分钟;
   4.用1xPBS稀释捕获抗体至说明书上要求的浓度;
   5.轻轻颠倒或振荡混匀,一定不要产生气泡;
   6.立即在每个ELISA板孔中加入100uL捕获抗体;
   7.将封板膜用力压盖在ELISA板上,注意不要使抗体滴溅在封板膜上;
   8.25℃孵育过夜,或者37℃孵育2-4个小时;
   9.洗板时需将液体倒掉,并在干净的吸水纸上拍干;
  10.每孔加入300ul 洗液,然后再将液体吸除;
  11.该步骤再重复3次,总共洗涤4次;
  12.最后一次洗涤后,将板倒置以去除液体,并在干净的吸水纸上拍干;
  13.ELISA板还有其它几种洗涤方法;
  14.无论使用哪种方法,请在整个ELISA实验过程中保持一致。
   
● 第二阶段:封闭非特异性结合
   1.牛血清白蛋白作为封闭试剂,可封闭塑料孔内任何未结合蛋白的位点;
   2.每孔中加入300ul封闭液;
   3.封板,并在25 ℃孵育至少1小时。

● 第3阶段:牛ELISA试剂盒实验抗原的特异性结合
   1.在上一孵育过程结束前;
   2.将标准品稍作离心;
   3.并用无菌水重悬至要求的浓度;
   4.静置至少10分钟,以使标准品完全溶解;
   5.重悬结束后,取出板并洗涤4次;
   6.重悬的标准品以最高速度离心3分钟;
   7.稀释到所需浓度,轻轻颠倒或振荡混匀;
   8.标准曲线在ELISA板上的区域专用于检测已知浓度的蛋白标准品;
   9.如果使用多道移液器,除第一列外的所有标准曲线孔中均加入100ul稀释液;
  10.然后,在标准曲线孔的第一列中加入200ul标准品溶液;
  11.依次倍比稀释,标准品至少有6个浓度;
  12.每个标准曲线孔中液体的终体积应为100ul;
  13.标准品至少有6个浓度,每个浓度为3个复孔,再设6个空白孔,其中仅含稀释液;
  14.空白孔是必须的,它们将用来评价试剂盒检测样本的效能;
  15.然后,在剩余孔中加入待测样本,每个样本设3个复孔;
  16.样本中若待检抗原的浓度过高,要得到最佳结果可能需对样本进行稀释。
  17.封板,25℃孵育2小时
   
● 第4阶段:加入生物素标记的检测抗体以形成夹心
   1.孵育结束前,稍离心检测抗体,并用无菌水重悬,静置10分钟;
   2.孵育结束后,取出板,洗涤4次;
   3.最高速度离心3分钟;
   4.用稀释液将检测抗体稀释至要求的浓度;
   5.轻轻混匀,立即在每孔中加入100ul检测抗体液;
   6.封板,25℃孵育2小时。

● 第5阶段:夹心上加酶联亲合素
   1.板在孵育过时,从冰箱中取出一管Avindin-HRP(6ul),使其融化;
   2.板孵育结束后,洗涤4次;
   3.用稀释液1:2000稀释Avidin-HRP;
   4.轻轻混匀,立即向每孔中加入100ul;
   5.封板,25℃孵育30分钟;
   6.为降低背景干扰,请确保孵育时间正好为30分钟。

● 阶段6:底物显色
   1.孵育结束后,立即洗板。每孔加入100ul ABTS底物溶液;
   2.Avidin-HRP仅可与ABTS配合使用;
   3.如与TMB或其它底物溶液配合使用,会显著提高背景显色;
   4.室温孵育显色;
   5.每隔5分钟读板一次,最长可监测60分钟;
   6.在酶标仪上设置合适的校正波长;
   7.EDK不同,以及说明书上所要求的读板时间不同均可能导致OD值的差异。
  
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